人EGFR突變基因檢測試劑注冊申報現狀及共性問題概述
1.前言
人表皮因子生長受體（EGFR）突變基因檢測試劑是指基于位點特異熒光-核酸聚合酶鏈式反應（ARMS-PCR法）、基因測序方法等技術，以EGFR突變基因序列為檢測目標，體外檢測人體病理組織和/或外周血等樣本的體外診斷試劑。人EGFR突變基因是腫瘤個體化靶向治療分子，目前靶向EGFR突變基因的藥物主要有兩類：一類是作用于EGFR胞外區的單克隆抗體，阻斷EGFR與配體的結合，從而阻斷下游信號轉導途徑；一類是作用于胞內酪氨酸激酶活性區域的小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），如gefitinib和erlotinib。研究表明EGFR突變基因在多種腫瘤細胞中存在，這些突變基因是腫瘤患者是否對TKI敏感的預測因子且被認為是TKI治療的有效預測指標。
隨著一代EGFR-TKIs治療藥物的使用，也發現了一些可能的耐藥突變，如發生在外顯子20上的替代突變T790M。針對這些耐藥突變，目前也開發了一些新型藥物，如針對T790M耐藥的新藥物等。此外，還有許多類型的突變臨床意義尚不明確。
2.該類產品注冊審評現狀
在我國依據《體外診斷試劑注冊管理辦法》，人EGFR突變基因檢測試劑屬于與人基因檢測相關的試劑，按照第三類產品進行管理。在美國FDA，人EGFR突變基因檢測試劑被歸為體細胞突變基因檢測系統，按照上市前審批（PMA）管理。檢測人EGFR突變基因的方法學主要有位點特異PCR熒光探針法，基因測序法，數字PCR法等，不同方法學之間在檢測性能方面也存在明顯差異。
3.人EGFR突變基因檢測試劑申報過程中的共性問題
3.1產品說明書中預期用途的表述
目前該類產品申報說明書中存在預期用途指向不明確、表述不清晰等問題。申請人需規范預期用途表述形式，結合該類產品臨床評價數據與腫瘤個體化診療藥物聯合治療情況客觀描述產品預期用途。依據《體外診斷試劑產品說明書指導原則》要求，預期用途需規范EGFR不同突變基因型別表達形式，明確產品外顯子、突變位點、cosmic代碼等信息。
申請人需依據自身完成的藥物診療個體化伴隨檢測研究工作，注意寫明申報產品與個體化腫瘤藥物聯合臨床研究相關信息。介紹EGFR突變基因檢測的臨床背景，包括檢測相關適用人群特征、腫瘤組織類型、適用樣本類型、待測靶基因序列特征及選擇依據，靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發生、發展過程中可能起到作用，相關藥物或其他治療技術及其作用機理、與待測突變位點可能存在關系等。
3.2臨床研究相關問題
研究表明，EGFR突變基因被檢測人群之間存在種族差異。亞裔人群中非小細胞肺癌患者EGFR突變基因陽性率明顯高于高加索人群，但目前我國人群腫瘤突變基因數據庫缺乏，申請人進行該試劑注冊申報前均需完成我國境內臨床研究資料，滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》要求，且需提供EGFR基因型與腫瘤個體化治療臨床意義相關研究資料。非小細胞肺癌人群中，如申報產品部分可檢測基因型未發現存在該類突變基因陽性結果，可能與該部分突變基因在我國人群突變頻率較低或總樣本人群選擇存在偏倚有關。針對該類問題，建議申請人擴大臨床樣本人群或根據不同突變基因突變頻率特點，增加不同地域的臨床研究機構，提高這部分突變基因陽性檢出率。
3.3關于檢測人外周血樣本相關問題
申報產品中最常見的樣本類型為中性福爾馬林固定石蠟包埋病理組織（病理）,且獲取腫瘤基因相關信息的主要來源仍是腫瘤病理組織樣本。研究結果表明，隨著腫瘤細胞的凋亡，腫瘤游離DNA（ctDNA）片段釋放到人體血液循環中，通過對外周血腫瘤游離DNA的檢測解讀，也可以較好地了解腫瘤病情的發展情況以及尋找適合的治療方案，尤其對于那些無法通過手術取得腫瘤組織或希望在治療后對病情進行跟蹤隨訪的人群，是一種理想和有效的檢測手段。但由于血液游離DNA含量及變異情況會隨著腫瘤病情的發展、轉移性腫瘤的發生以及用藥治療情況發生實時的變化，外周血檢測EGFR突變基因檢測結果存在一定的不確定性。兩種樣本在用于人EGFR-TIK治療效果也存在差異。
鑒于上述原因，人EGFR突變基因檢測試劑如適用于外周血樣本檢測人群，預期用途需限定為晚期NSCLC患者，且作為不能獲取NSCLC組織樣本時的補充手段。鑒于病理組織樣本和外周血樣本中EGFR突變基因比例不同，申報產品需分別對檢測外周血樣本和病例組織樣本進行最低檢出限的研究。
3.4關于適用樣本采集儲存相關問題
病理組織樣本需詳細介紹組織學樣本類型，包括樣本來源及取材要求、組織標本采集厚度、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細胞比例等。在對核酸序列進行檢測前，需對用于腫瘤組織突變基因檢測的標本進行評估，并富集存在EGFR突變基因的腫瘤細胞用于核酸提取。腫瘤細胞所占比例需達到所用檢測方法的要求。
外周血采集后，需通過驗證試驗規定外周血存放條件以及存放時限及溫度設置等，包括采用加入抗核酸降解的采血管要求。樣本采集管或保存管中所用的防腐劑、抗凝劑、保護劑等輔助成分不應對基因序列擴增產生干擾。血液通常需要先進行抗凝保存，應關注抗凝劑的選擇。申請人需對抗凝劑、防腐劑、保護劑等成分進行驗證。
因外周血中ctDNA含量低，為提高EGFR突變基因檢出率，在臨床允許的情況下推薦增加血漿用量。抽血后延遲血漿分離會導致血細胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中；大量增加的gDNA會稀釋腫瘤來源的ctDNA，使得突變難以檢出。因此在標本采集、運輸及儲存過程中，防止游離DNA降解是首要考慮因素；其次，也應防止血液中白細胞裂解，避免因野生型DNA增加導致ctDNA中EGFR突變基因無法檢測。
3.5產品研發申報難點
人EGFR突變基因檢測試劑聯合治療產品使用，用于指導用藥或者預后判斷，該類產品屬于伴隨診斷產品，與治療藥物使用安全有效密切相關。美國FDA曾發布伴隨診斷產品指導文件，鼓勵申請人同步進行治療產品與伴隨診斷產品研發與上市前申請。我中心鼓勵申請人在伴隨診斷試劑研發時應充分聯合治療藥物對產品進行臨床評價。但國內具體開發創新性腫瘤個體化藥物的生產企業較少，目前多為國外專利期到期后腫瘤個體化藥物的仿制藥研究。這也給從事該類體外診斷試劑的生產企業開展創新性腫瘤個體化伴隨臨床研究帶來困難。
4.小結
人EGFR突變基因檢測目前是EGFR-TKIs治療的重要檢測靶點，隨著核酸檢測技術的發展，如：BEAMing技術、數字PCR、高通量測序技術運用于腫瘤個體化治療，相關突變基因檢測越來越受到臨床專家和行業研究人員關注。不同于目前臨床常規成熟且推薦的檢測技術，新的檢測技術如何定位、臨床個體化應用與臨床個體化研究兩者存在差異、臨床轉化醫學研究如何有效轉化為臨床應用，都將是今后注冊審評關注重點。
參考文獻：
1. FDA,In Vitro Companion Diagnostic Devices,Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff, 2014-08-06.
2.《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制定專家組.非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識. 中華醫學雜志2015年12月8日第95卷第46期
3.中國醫師協會腫瘤醫師分會，中國抗癌協會腫瘤臨床化療專業委員會.中國表皮生長因子受體基因敏感突變和間變淋巴瘤激酶融合基因陽性非小細胞肺癌診斷治療指南(2014版) 中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期
審評六部 吳傳松供稿
人表皮因子生長受體（EGFR）突變基因檢測試劑是指基于位點特異熒光-核酸聚合酶鏈式反應（ARMS-PCR法）、基因測序方法等技術，以EGFR突變基因序列為檢測目標，體外檢測人體病理組織和/或外周血等樣本的體外診斷試劑。人EGFR突變基因是腫瘤個體化靶向治療分子，目前靶向EGFR突變基因的藥物主要有兩類：一類是作用于EGFR胞外區的單克隆抗體，阻斷EGFR與配體的結合，從而阻斷下游信號轉導途徑；一類是作用于胞內酪氨酸激酶活性區域的小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI），如gefitinib和erlotinib。研究表明EGFR突變基因在多種腫瘤細胞中存在，這些突變基因是腫瘤患者是否對TKI敏感的預測因子且被認為是TKI治療的有效預測指標。
隨著一代EGFR-TKIs治療藥物的使用，也發現了一些可能的耐藥突變，如發生在外顯子20上的替代突變T790M。針對這些耐藥突變，目前也開發了一些新型藥物，如針對T790M耐藥的新藥物等。此外，還有許多類型的突變臨床意義尚不明確。
2.該類產品注冊審評現狀
在我國依據《體外診斷試劑注冊管理辦法》，人EGFR突變基因檢測試劑屬于與人基因檢測相關的試劑，按照第三類產品進行管理。在美國FDA，人EGFR突變基因檢測試劑被歸為體細胞突變基因檢測系統，按照上市前審批（PMA）管理。檢測人EGFR突變基因的方法學主要有位點特異PCR熒光探針法，基因測序法，數字PCR法等，不同方法學之間在檢測性能方面也存在明顯差異。
3.人EGFR突變基因檢測試劑申報過程中的共性問題
3.1產品說明書中預期用途的表述
目前該類產品申報說明書中存在預期用途指向不明確、表述不清晰等問題。申請人需規范預期用途表述形式，結合該類產品臨床評價數據與腫瘤個體化診療藥物聯合治療情況客觀描述產品預期用途。依據《體外診斷試劑產品說明書指導原則》要求，預期用途需規范EGFR不同突變基因型別表達形式，明確產品外顯子、突變位點、cosmic代碼等信息。
申請人需依據自身完成的藥物診療個體化伴隨檢測研究工作，注意寫明申報產品與個體化腫瘤藥物聯合臨床研究相關信息。介紹EGFR突變基因檢測的臨床背景，包括檢測相關適用人群特征、腫瘤組織類型、適用樣本類型、待測靶基因序列特征及選擇依據，靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發生、發展過程中可能起到作用，相關藥物或其他治療技術及其作用機理、與待測突變位點可能存在關系等。
3.2臨床研究相關問題
研究表明，EGFR突變基因被檢測人群之間存在種族差異。亞裔人群中非小細胞肺癌患者EGFR突變基因陽性率明顯高于高加索人群，但目前我國人群腫瘤突變基因數據庫缺乏，申請人進行該試劑注冊申報前均需完成我國境內臨床研究資料，滿足《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》要求，且需提供EGFR基因型與腫瘤個體化治療臨床意義相關研究資料。非小細胞肺癌人群中，如申報產品部分可檢測基因型未發現存在該類突變基因陽性結果，可能與該部分突變基因在我國人群突變頻率較低或總樣本人群選擇存在偏倚有關。針對該類問題，建議申請人擴大臨床樣本人群或根據不同突變基因突變頻率特點，增加不同地域的臨床研究機構，提高這部分突變基因陽性檢出率。
3.3關于檢測人外周血樣本相關問題
申報產品中最常見的樣本類型為中性福爾馬林固定石蠟包埋病理組織（病理）,且獲取腫瘤基因相關信息的主要來源仍是腫瘤病理組織樣本。研究結果表明，隨著腫瘤細胞的凋亡，腫瘤游離DNA（ctDNA）片段釋放到人體血液循環中，通過對外周血腫瘤游離DNA的檢測解讀，也可以較好地了解腫瘤病情的發展情況以及尋找適合的治療方案，尤其對于那些無法通過手術取得腫瘤組織或希望在治療后對病情進行跟蹤隨訪的人群，是一種理想和有效的檢測手段。但由于血液游離DNA含量及變異情況會隨著腫瘤病情的發展、轉移性腫瘤的發生以及用藥治療情況發生實時的變化，外周血檢測EGFR突變基因檢測結果存在一定的不確定性。兩種樣本在用于人EGFR-TIK治療效果也存在差異。
鑒于上述原因，人EGFR突變基因檢測試劑如適用于外周血樣本檢測人群，預期用途需限定為晚期NSCLC患者，且作為不能獲取NSCLC組織樣本時的補充手段。鑒于病理組織樣本和外周血樣本中EGFR突變基因比例不同，申報產品需分別對檢測外周血樣本和病例組織樣本進行最低檢出限的研究。
3.4關于適用樣本采集儲存相關問題
病理組織樣本需詳細介紹組織學樣本類型，包括樣本來源及取材要求、組織標本采集厚度、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細胞比例等。在對核酸序列進行檢測前，需對用于腫瘤組織突變基因檢測的標本進行評估，并富集存在EGFR突變基因的腫瘤細胞用于核酸提取。腫瘤細胞所占比例需達到所用檢測方法的要求。
外周血采集后，需通過驗證試驗規定外周血存放條件以及存放時限及溫度設置等，包括采用加入抗核酸降解的采血管要求。樣本采集管或保存管中所用的防腐劑、抗凝劑、保護劑等輔助成分不應對基因序列擴增產生干擾。血液通常需要先進行抗凝保存，應關注抗凝劑的選擇。申請人需對抗凝劑、防腐劑、保護劑等成分進行驗證。
因外周血中ctDNA含量低，為提高EGFR突變基因檢出率，在臨床允許的情況下推薦增加血漿用量。抽血后延遲血漿分離會導致血細胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中；大量增加的gDNA會稀釋腫瘤來源的ctDNA，使得突變難以檢出。因此在標本采集、運輸及儲存過程中，防止游離DNA降解是首要考慮因素；其次，也應防止血液中白細胞裂解，避免因野生型DNA增加導致ctDNA中EGFR突變基因無法檢測。
3.5產品研發申報難點
人EGFR突變基因檢測試劑聯合治療產品使用，用于指導用藥或者預后判斷，該類產品屬于伴隨診斷產品，與治療藥物使用安全有效密切相關。美國FDA曾發布伴隨診斷產品指導文件，鼓勵申請人同步進行治療產品與伴隨診斷產品研發與上市前申請。我中心鼓勵申請人在伴隨診斷試劑研發時應充分聯合治療藥物對產品進行臨床評價。但國內具體開發創新性腫瘤個體化藥物的生產企業較少，目前多為國外專利期到期后腫瘤個體化藥物的仿制藥研究。這也給從事該類體外診斷試劑的生產企業開展創新性腫瘤個體化伴隨臨床研究帶來困難。
4.小結
人EGFR突變基因檢測目前是EGFR-TKIs治療的重要檢測靶點，隨著核酸檢測技術的發展，如：BEAMing技術、數字PCR、高通量測序技術運用于腫瘤個體化治療，相關突變基因檢測越來越受到臨床專家和行業研究人員關注。不同于目前臨床常規成熟且推薦的檢測技術，新的檢測技術如何定位、臨床個體化應用與臨床個體化研究兩者存在差異、臨床轉化醫學研究如何有效轉化為臨床應用，都將是今后注冊審評關注重點。
參考文獻：
1. FDA,In Vitro Companion Diagnostic Devices,Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff, 2014-08-06.
2.《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》制定專家組.非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識. 中華醫學雜志2015年12月8日第95卷第46期
3.中國醫師協會腫瘤醫師分會，中國抗癌協會腫瘤臨床化療專業委員會.中國表皮生長因子受體基因敏感突變和間變淋巴瘤激酶融合基因陽性非小細胞肺癌診斷治療指南(2014版) 中華腫瘤雜志2014年7月第36卷第7期
審評六部 吳傳松供稿